熒光染料會結合到DNA的A-T福集區域，因為支原體的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可將其染色而檢測。這種方法是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測支原體污染。被支原體污染的細胞經染色后在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點，即為支原體的DNA，證明有支原體污染。
有簡單、經濟與靈敏，廣泛使用的特點，可作為例行的檢測手段。可以檢測不易培養的支原體，例如M.hyorhinis，比直接培養法快，約一周既可知道結果。但有時會有背景熒光，影響結果判斷。
所使用的材料如下：
Hank''s balanced
saltsolution（不含NaHCO3和酚紅，HBSS，GibcoBRL21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，HoechstNo.33258，SigmaB-2883）、thimerosol（Sigma
T-5125）、0.1M檸檬酸、0.2M磷酸氫二鈉、甘油、冰醋酸、甲醇、無菌水、chamber
slide（Nunc177380）或其替代物：35或60mm細胞培養皿內放無菌22x22mm蓋玻片（浸于酒精中用前過火滅菌），染色后取出蓋玻片細胞面朝下放玻片上觀察。
指示細胞：Vero（ATCCCCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC
CCL-96或CCRC60070），細胞須先測試無污染。MEM，10%FBS（Vero的培養液）。
試劑準備：無菌HBSS：配置Hank''s balanced salt solution，用0.22um無菌濾膜過濾除菌。 Hoechst33258
儲存液（100x）：稱取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml/支分裝到1.5ml小離心管中，-20℃保存。
Hoechst 33258 工作液：取1ml儲存液加入100ml無菌HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以錫箔紙包裹，避廣光保存于4℃。
封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M
檸檬酸和27.8ml0.2MNa2HPO4加入50ml甘油中，用1NNaOH調pH至5.5（pH很重要），4℃保存。
固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。
操作流程：
1.培養Vero細胞：Vero細胞可作長期培養或制作多個凍存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。
2.在接種待測樣品前一日，將Vero細胞以1-2x104細胞/ml培養于chamber
slide中，每孔加入1ml細胞懸浮液，于37℃，5%CO2培養。隔日確定生長良好后即可接種待測樣品細胞。
3.接種待測樣品：樣品種類：1ml待測的培養基，1ml待測的細胞培養液（可刮下少許細胞）0.05-0.1ml 冷凍管的細胞懸浮液。
4.將待測樣品加入chamberslide內培養5天后，進行Hoechst33258的熒光染色觀察。
5.以Acholeplasmalaidlawii ATCC23206感染Vero細胞作陽性對照，陰性對照用Vero細胞的新鮮培養基（MEM+10%FBS）。
DNA熒光染色檢測：
6.取出培養5天的Vero細胞，吸除培養液。每孔加2ml固定液，靜置十分鐘后吸除固定液，重復一次，風干10分鐘。
7.每孔加入1mlHoechst33258 工作液，室溫下靜置30分鐘。
8.吸掉Hoeshst33258染液后，用無菌水洗滌3次，風干后加入1滴封固溶液，并以蓋玻片蓋之。
9.用100-400x熒光顯微鏡觀察。打開汞燈10分鐘后，用UV激發光（330-380nm）的濾光鏡，觀察細胞核外是否有蘭色熒光小點或絲狀點的熒光。
結果判斷：如有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現蘭色熒光小點或絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成的不規則點狀物不同。其熒光可維持數周。
