怎樣選擇色譜柱 現(xiàn)代高效液相色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。 1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán) (NH2,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。 由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱。
正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料
聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。
相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。
現(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。 三、其他無(wú)機(jī)填料
其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。 怎樣選擇填料粒度 目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時(shí)間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。 一、如何保證良好的柱性能與柱壽命
◆ 認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書；
◆ 使用填充良好的色譜柱；
◆ 盡量減少壓力波動(dòng)，避免機(jī)械及熱沖擊；
◆ 使用保護(hù)柱及在線過濾器；
◆ 經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；
◆ 充分過濾樣品及流動(dòng)相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；
◆ 用穩(wěn)定的固定相（C18最穩(wěn)定）；
◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機(jī)緩沖溶液；
◆ 色譜柱使用溫度最好小于40℃；
◆ 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動(dòng)相的PH值范圍在3.0~8.0；
◆ 在水流動(dòng)相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；
◆ 流動(dòng)相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；
◆ 過夜或貯存時(shí)，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動(dòng)相保存（乙晴最好）。
正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica），以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán) (NH2,APS)和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。 由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱。
正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料
聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。
相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。
現(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。 三、其他無(wú)機(jī)填料
其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。 怎樣選擇填料粒度 目前，商品化的色譜料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料應(yīng)用，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選擇更小粒度的填料是很有用的，3um填料填充柱的柱數(shù)比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色相譜的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選擇更短的色譜柱，以縮短分析時(shí)間，另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。 一、如何保證良好的柱性能與柱壽命
◆ 認(rèn)證閱讀色譜柱使用說明書；
◆ 使用填充良好的色譜柱；
◆ 盡量減少壓力波動(dòng)，避免機(jī)械及熱沖擊；
◆ 使用保護(hù)柱及在線過濾器；
◆ 經(jīng)常以強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱；
◆ 充分過濾樣品及流動(dòng)相，盡量避免雜質(zhì)微粒與強(qiáng)保留成分；
◆ 用穩(wěn)定的固定相（C18最穩(wěn)定）；
◆ 在中等PH值操作（6~8），用有機(jī)緩沖溶液；
◆ 色譜柱使用溫度最好小于40℃；
◆ 硅膠基質(zhì)的的色譜柱，應(yīng)保持流動(dòng)相的PH值范圍在3.0~8.0；
◆ 在水流動(dòng)相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉；
◆ 流動(dòng)相中含有緩沖溶液，應(yīng)注意應(yīng)95∶5的水及有機(jī)溶劑過渡，有機(jī)溶劑不能低于5%；
◆ 過夜或貯存時(shí)，沖洗掉鹽和緩沖液，用純有機(jī)溶劑流動(dòng)相保存（乙晴最好）。
